Cuando se inventaron los microscopios alrededor de 1600 E.C., los filósofos naturales volvieron sus ojos hacia un mundo dentro de un mundo. Cuando Antony van Leeuwenhoek diseñó lentes pequeñas y altamente curvadas y un soporte mecánico para ajustar la vista, abrió una ventana al mundo microscópico de bacterias, células sanguíneas, protozoos y la estructura celular de las plantas. Pero a lo largo de la historia de la microscopía, siempre ha habido una pregunta: ¿Qué son estas cosas extrañas vistas a través de una lente? La microscopía de fluorescencia se refiere a un conjunto de técnicas que minimiza esa incertidumbre, porque en la microscopía de fluorescencia, cuando la luz brilla en una muestra, ilumina su propia luz de regreso.
Epifluorescencia
De lejos, la El microscopio de fluorescencia más común es la configuración de epifluorescencia. En un microscopio de epifluorescencia, una fuente de luz, generalmente una lámpara de mercurio o xenón, brilla a través de un filtro que selecciona una región estrecha de longitudes de onda. La luz filtrada brilla sobre la muestra a través de la lente objetivo del microscopio. La luz entrante es absorbida por los fluoróforos, etiquetas moleculares que emiten luz de una longitud de onda larga cuando absorben luz de una longitud de onda más corta. La luz de los fluoróforos, junto con la luz dispersa de la fuente de iluminación, regresa a la lente del objetivo y al detector u ojo. En el camino, otro filtro bloquea la luz de iluminación, por lo que todo lo que queda es la luz fluorescente de la muestra.
Confocal
Un microscopio de epifluorescencia recoge la luz de todas partes dentro del campo de visión del microscopio. . Parte de la luz de excitación se absorbe antes del plano focal del microscopio, algunas en el plano focal y otras más allá del plano focal. Debido a que el microscopio recoge toda esa luz, la imagen contendrá una imagen nítida de luz en el foco, pero también tendrá luz desenfocada de otras regiones. Un microscopio confocal corrige que al enfocar un punto láser en el mismo plano que se enfoca el microscopio. Luego, un orificio pasa delante del detector, donde bloquea toda la luz que no proviene del foco del microscopio. Al escanear la muestra, se puede obtener una imagen tridimensional limpia del objeto.
Multiphoton
En un microscopio confocal, la alineación es muy sensible. Si el punto del láser, el objetivo del microscopio, la óptica de recolección y el orificio del alfiler están apagados, incluso la menor cantidad que sufre el rendimiento del microscopio. Un microscopio multiphoton soluciona este problema usando una longitud de onda láser que es solo la mitad de la energía necesaria para excitar los fluoróforos en la muestra. La única forma en que los fluoróforos se excitan y emiten fluorescencia es si la luz láser es lo suficientemente brillante como para que dos partículas de luz, los fotones, lleguen al fluoróforo en muy poco tiempo. Eso sucede solo cuando el láser se enfoca en un punto muy pequeño. Por lo tanto, el único lugar en la muestra que emitirá luz es donde se enfoca el láser, lo que mantiene la imagen agradable y limpia porque no hay luz de fondo adicional para eliminar, lo que significa que no hay ningún orificio para alinear.
Fluorescencia total de reflexión interna (TIRF)
Otra forma de obtener imágenes muy limpias es asegurarse de que la luz de excitación no llegue muy lejos en la muestra. Si una gota de neuronas, por ejemplo, se coloca en una gota de solución en un portaobjetos de vidrio, algunas de las neuronas se adherirán a la superficie del vidrio. En un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), la luz se dirige lateralmente hacia el portaobjetos de vidrio, por lo que realmente no llega a la solución que contiene las células. Pero parte de la luz apenas se filtra a la solución, muy cerca de la superficie del vidrio. Esto significa que los únicos lugares que emitirán luz estarán en una región muy delgada contra la superficie del vidrio. Para algo como las neuronas, donde suceden tantas cosas interesantes en la superficie de las células, esta técnica puede ser muy efectiva.
Superresolución
Todos los microscopios, incluidos los microscopios de fluorescencia, están limitados por física que gobierna la propagación de la luz. Una de las reglas básicas es que un punto de luz enfocado solo puede ser tan pequeño, y no más pequeño. Para la luz visible, ese tamaño es de aproximadamente 200 nanómetros, o 200 billonésimas de metro. Pero las moléculas individuales tienen solo unos pocos nanómetros de tamaño, por lo que hay muchas características interesantes que están por debajo de ese límite de tamaño, llamado límite de difracción. Los científicos están desarrollando técnicas de "superresolución" para escabullirse de ese límite. La microscopía de iluminación estructurada (SIM) y la microscopía de reducción de emisión estimulada (STED), por ejemplo, son métodos de microscopía de fluorescencia que limitan el tamaño del punto emisor de luz al reducir el tamaño del punto de luz de excitación.
[Tipos de microscopios de fluorescencia] URL: http://www.ordenador.online/computadora/Hardware/239023.html